AIMS Virtual 系列丨腦內(nèi)膽固醇空間代謝成像

2022.5.30

2015年，美國(guó)發(fā)布新版《居民膳食指南》，不再限制膽固醇攝入量。因其并非直接反應(yīng)血液中的膽固醇水平，存在個(gè)體代謝差異。

膽固醇與心血管疾病相關(guān)性的世紀(jì)爭(zhēng)論由來(lái)已久。不過(guò)，今天我們要談的是大腦中的膽固醇。

實(shí)際上，膽固醇是維持人體新陳代謝不可或缺的脂類，廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，尤以腦組織中最為豐富，與衰老特別是神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如帕金森病或阿爾茲海默癥等。

血液中的膽固醇因存在血腦屏障不能進(jìn)入大腦。腦中膽固醇主要由大腦自行合成，且分布不均，代謝活躍度也不一致。因此，我們需要對(duì)大腦不同功能區(qū)的膽固醇代謝進(jìn)行精確成像。

英國(guó)斯旺西大學(xué)醫(yī)學(xué)院將兩種原位電離技術(shù) AP/MALDI 和 LESA Plus 與 Orbitrap 質(zhì)譜聯(lián)用來(lái)對(duì)腦組織切片（10 μm 厚）中的膽固醇及其代謝物進(jìn)行高空間分辨率（＜10 μm 分辨率）或高靈敏度（pg/mg）成像?！?strong style="margin:0px;padding:0px;max-width:100%;">2021 AIMS Virtual 原位質(zhì)譜網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)》上（點(diǎn)擊查看），William J. Griffiths 教授在報(bào)告中展示了這些技術(shù)在鼠腦和人腦中的應(yīng)用成果。

膽固醇代謝物含量比膽固醇本身至少低2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，為了提高離子化效率和靈敏度，研究人員使用?SunCollect 基質(zhì)噴涂?jī)x對(duì)鼠腦中膽固醇及其代謝物進(jìn)行原位衍生化，并用同樣的方法加入氘代同位素內(nèi)標(biāo)（600 ng/μL）。

圖1. 原位衍生化流程圖

圖2. 膽固醇衍生化反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：開(kāi)發(fā)一種適用于小鼠大腦不同區(qū)域中不同甾醇和氧化甾醇（包括膽甾烯酸）的低水平定量測(cè)定的 MS 方法。

圖3. LESA 腦組織取樣后留下的痕跡的顯微鏡視圖

圖4. LESA-LC-MS 運(yùn)行原理圖

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圖5. （A）GP-衍生化膽固醇在不同腦區(qū)分布（MALDI成像）（B）全腦中9個(gè)不同腦區(qū)

圖6. LESA-LC-MS 分析小鼠大腦切片，不同物質(zhì)在不同腦區(qū)的分布差異。（A）膽固醇、（B）地甾醇、（C）8-DHC、（D）24S-HC 和（E）24S, 25-EC。（F）艾倫腦圖譜顯示 Cyp46a1分布

24S-羥基膽固醇（24S-HC）是膽固醇的主要代謝物，占總代謝物50%。它在9個(gè)腦區(qū)分布的有顯著差異，丘腦（thalamus）和紋狀體（striatum）中含量最高，分別達(dá)到1.637±0.159 ng/mm²和1.805±0.158 ng/mm²，而在小腦灰質(zhì)中含量?jī)H為0.161±0.024 ng/mm²。最高和最低含量差異高達(dá)10倍，而其他膽固醇代謝物在不同腦區(qū)分布差異僅為2~4倍。圖6. D?展示了 LESA 指示的24S-HC 在不同腦區(qū)的分布差異，紅色為高含量區(qū)，藍(lán)色為低含量區(qū)。

圖7.（左）膽固醇及代謝物在不同腦區(qū)的層次聚類分析圖。每個(gè)柱形表示一只小鼠，圓點(diǎn)數(shù)為切片數(shù)，柱形下方數(shù)字為取點(diǎn)數(shù)。（右）24S-HC 在不同腦區(qū)差異大小的樹(shù)狀圖。

經(jīng)過(guò)層次聚類分析（hierarchal cluster analysis），兩兩比較不同腦區(qū)的24S-HC 含量，結(jié)果顯示所有腦區(qū)的24S-HC 均存在顯著性差異（圖6.G和H），且大部分p＜0.001。

有趣的是，24S-HC 與其前體膽固醇（圖7.A）分布并不相同。而將24S-HC 與艾倫腦圖譜（Allen Brian Atlas）的 Cyp46a1酶分布進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者分布規(guī)律一致（如圖6.F?所示）。Cyp46a1 酶可將膽固醇轉(zhuǎn)化為24S-HC，它的高表達(dá)可以減少亨廷頓?。℉D）模型小鼠發(fā)病，因而有種亨廷頓病的基因療法就是誘導(dǎo)產(chǎn)生 Cyp46a1酶。所以，可以通過(guò)24S-HC 分布獲知 Cyp46a1表達(dá)。

盡管由 Cyp46a1介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)化為24S-HC 是膽固醇主要的轉(zhuǎn)化方式，Cyp46a1^-/-動(dòng)物與野生型的全腦膽固醇含量并無(wú)顯著差異。這可以解釋為Cyp46a1^-/-動(dòng)物體內(nèi)膽固醇合成減少，課題組設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這一說(shuō)法。

圖8. 膽固醇合成和轉(zhuǎn)化代謝流程圖，紅框部分所示，由于 Cyp46a1缺乏，如果膽固醇合成減少補(bǔ)償了無(wú)法代謝的部分（即DHCR7減弱），則24S，24S，25-環(huán)氧膽固醇（24S，25-EC）含量應(yīng)減少。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在?Cyp46a1^-/-小鼠中24S，25-EC 明顯降低（見(jiàn)圖9縱坐標(biāo)軸），DHCR7 引起的膽固醇合成減弱彌補(bǔ)了 Cyp46a1缺失引起的膽固醇代謝受阻，而且不同部位所受影響不同。在丘腦和紋狀體中，24S,25-EC 降低80%~90%，而在髓質(zhì)和小腦中，僅降低約50%。

圖9. 24S,25-EC 在野生型小鼠（A）和?Cyp46a1^-/-小鼠（B）不同腦區(qū)的含量分布

此外，課題組研究了其他多種膽固醇代謝途徑和分布。這項(xiàng)工作證明了 LESA 和（AP）MALDI 聯(lián)用在代謝途徑和分布研究中的意義，（AP）MALDI 可達(dá)到10-50 μm 的高成像空間分辨率，LESA 可高靈敏度覆蓋0.01-500 ng/mm²濃度范圍，本研究中檢測(cè)限（LOD）為0.001 ng/mm²，定量限為0.01 ng/mm²?（CV＜25%），結(jié)合 SunCollect 高精度噴涂?jī)x添加內(nèi)標(biāo)和原位衍生化，可以進(jìn)一步提高這兩種成像方式的靈敏度和穩(wěn)定性。這將是研究健康和病變組織特定區(qū)域的有力工具，可用于即時(shí)評(píng)估檢測(cè)組織中膽固醇及其代謝物的變化和分布。

現(xiàn)場(chǎng)互動(dòng)：

Q：如何確保膽固醇已經(jīng)完全氧化，該方法可以用于研究其他脂質(zhì)嗎？

A：在做測(cè)試實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，沒(méi)有檢測(cè)到未被氧化的膽固醇。這種衍生化是針對(duì)酮基（ketone），因此只要是酮，都可以使用這種方法。有些含磷的試劑可以衍生化氨基（amino）。并且，在原位衍生化時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)空間分辨率降低。因此，我想給大家推薦這種方法，值得一試。

●?文獻(xiàn)來(lái)源：

Eylan Yutuc, William J. Griffiths, et al. Localization of sterols and oxysterols in mouse brain reveals distinct spatial cholesterol metabolism. Proc Natl Acad Sci USA. 117(11) (2020) 5749-5760.?

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1917421117

關(guān)于液滴萃取表面分析 LESA

LESA 多通道納噴離子源利用機(jī)器人抓取、轉(zhuǎn)移和連接樣品與刻蝕于芯片上的400個(gè)高度重現(xiàn)的獨(dú)立噴針，進(jìn)行全自動(dòng)的納升電噴霧質(zhì)譜分析，實(shí)現(xiàn)其他納噴質(zhì)譜或常規(guī)液質(zhì)不能實(shí)現(xiàn)的功能：

（1）納升級(jí)注射全自動(dòng)電噴霧直接進(jìn)樣，無(wú)需清洗，自動(dòng)分析達(dá)400個(gè)樣品；零殘留、高靈敏度。適于活性物質(zhì)或代謝物及毒性成分的鑒定解析；對(duì)組學(xué)分析、ADCs 抗體藥物偶聯(lián)物、非共作用研究特效。

（2）餾分收集，以信號(hào)累加方式鑒定復(fù)雜基質(zhì)中的痕量未知物。

（3）在線 nanoLC-MS 接口，可自動(dòng)感應(yīng)噴霧電流和堵塞，3秒自動(dòng)移換噴頭，實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守的連續(xù)分析，保障超長(zhǎng)時(shí)間 nanoLC-MS 分析的連貫性、重復(fù)性。

（4）表面輪廓分析，以一滴溶劑在中藥切片、生物體組織、培養(yǎng)皿、藥材、薄層板、MALDI 板等特定表面進(jìn)行1秒的微萃取，納升電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)分子成像和或分布輪廓分析（0.4毫米空間分辨率）。

（5）可升級(jí)為 LESA Plus，液滴萃取后，通過(guò)六通閥切換萃取液至納升或微升柱，分離后再納噴質(zhì)譜檢測(cè)。LESA兼容主流質(zhì)譜廠商（Agilent、SCIEX、ThermoFisher、Waters、Bruker、Shimadzu）各類型質(zhì)譜儀如 FTMS、Orbi、飛行時(shí)間、離子阱、三重四極桿及混聯(lián)質(zhì)譜。

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