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獨辟蹊徑：基于MALDI成像的空間代謝流分析策略

2024.1.25

1前言
瓦博格效應（Warburg effect）被認為是腫瘤代謝的一大特征，其內在機制十分復雜，雖近年來的研究提出并證實了相應的一些調控機制，但依然還有很多疑問亟待解決，因此，研究瓦博格效應中關鍵的調控節(jié)點有助于揭示腫瘤細胞轉移的機制，為腫瘤的靶向性治療提供很好的方向和策略。目前，腫瘤細胞中如何通過三羧酸（TCA）循環(huán)將葡萄糖轉化為乳酸鹽仍不明確，雖然磁共振波譜（MRS，Magnetic Resonance Spectroscopy）和正電子發(fā)射斷層掃描（PET，Positron Emission Topography）等技術已廣泛應用于腫瘤代謝通路的研究，但在通量上仍有一定的局限性。本文以MALDI質譜成像為主要分析技術，結合¹³C穩(wěn)定同位素示蹤法，直接呈現出膠質母細胞瘤中¹³C₆-葡萄糖的TCA代謝物的空間分布，有效地揭示了膠質瘤組織中TCA循環(huán)活性的下調特征。

2實驗方法

取病人來源的異種移植（PDX）的小鼠分別在0min和30min通過腹腔引入¹³C₆-葡萄糖，在60min后宰殺小鼠并獲取器官，制備小鼠腦膠質瘤組織的冷凍切片。將膠質瘤切片轉移到導電載玻片上，使用HTX M3+自動化基質噴涂儀噴涂N-(1-萘)乙二胺鹽酸鹽（NEDC）基質。通過timsTOF fleX MALDI-2、在負模式下進行20μm空間分辨率的MALDI成像實驗，使用SCiLS??Lab 2023a進行數據可視化，并在MetaboScape^??2023a進行分子注釋。在SCiLS REST API通過R語言提取母離子和所有碳同位素的強度信息。

圖1. 基于MALDI質譜成像的分析流程

3實驗結果與討論

圖2. A) 空白組和給藥組切片的光學圖片，其中深色區(qū)域為腫瘤；B) 空間聚類分析劃分的腫瘤區(qū)域和健康區(qū)域；C) 蘋果酸鹽[M+0]峰的離子熱圖；D) 蘋果酸鹽[M+1]峰的離子熱圖；E)主成分分析得分圖。

MALDI成像常常產生海量的數據，需要借助專業(yè)的軟件才能實現有效的數據挖掘。布魯克推出的SCiLS Lab軟件，集數據分析和數據可視化為一身。首先，SCiLS Lab對空白組和給藥組的鼠腦膠質瘤組織的成像數據進行空間聚類分析，將組織根據分子組成的差異性進行區(qū)域劃分。如圖2B所示，空白組切片可以劃分為橙色和綠色兩個區(qū)域，分別對應腫瘤區(qū)域和健康組織區(qū)域，而在給藥組切片中，劃分的藍色和黃色區(qū)域分別是健康組織區(qū)域和腫瘤區(qū)域。在此基礎之上，通過SCiLS Lab的“空間共定位”功能，可以進一步篩選出在腫瘤區(qū)域具有高表達的分子。圖2C和2D為蘋果酸的M+0和M+1峰的離子熱圖，蘋果酸在空白組和給藥組的腫瘤切片中均具有顯著表達。由于健康組織和腫瘤組織具有不同的分子表型，因此基于MALDI成像得到的分子圖譜可以快速地識別出空白組和給藥組中腫瘤區(qū)域。

圖3. 空白組和給藥組中腫瘤區(qū)域和健康區(qū)域差異性分析得到的ROC曲線

通過SCiLS Lab中的ROC分析、T檢驗可以快速篩選并驗證腫瘤組織和健康組織的差異性分子。圖3為ROC分析找到的差異性分子，AUC值越高，差異越明顯。以檸檬酸（m/z 191.0195）、谷氨酸鹽（m/z 146.0469）等為例，作為TCA循環(huán)中的重要代謝產物，它們均可以有效地區(qū)分空白組和給藥組中的腫瘤區(qū)域和健康區(qū)域。

圖4. TCA循環(huán)中代謝物的離子熱圖

此外，SCiLS Lab還提供了API擴展功能接口，可以方便用戶進行更靈活的數據處理。在本文中，通過R語言將所有母離子以及碳同位素的強度信息提取出來，從而對腫瘤組織中TCA循環(huán)中代謝物進行定量分析。圖4為TCA循環(huán)中典型代謝物的離子熱圖，參與循環(huán)的蘋果酸等在腫瘤區(qū)域的空間表達顯著高于健康組織區(qū)域。圖5為在¹³C₆-葡萄糖攝入后，乳酸和蘋果酸對應的代謝產物M+0、M+1、M+2、M+3和M+4的同位素相對強度比值；與健康組織相比，腫瘤組織中M+0的比例更高，而M+2、M+3和M+4的比例較低。結合上面兩部分數據，說明膠質瘤組織較健康區(qū)域TCA循環(huán)的活性發(fā)生顯著下調。

圖5. 健康-空白組、腫瘤-空白組、健康-給藥組和腫瘤-給藥組中TCA代謝物的相對強度比值（數據經過LC-MS驗證）

4結論

本文展示了基于布魯克timsTOF fleX MALDI-2質譜儀的空間代謝流分析流程。timsTOF fleX MALDI-2質譜儀可以實現高空間分辨率的質譜成像數據采集，配套的SCiLS?Lab軟件具有多元化統(tǒng)計分析功能和API擴展接口功能，可以對MALDI成像數據進行深入的分子信息挖掘。與傳統(tǒng)組學流程相比，MALDI成像獨特的“定位功能”優(yōu)勢能夠獲取動態(tài)條件下某一代謝通路在組織某個部位的含量變化，為理解腫瘤代謝過程提供了直觀、全面的動態(tài)分析視角，將對腫瘤的空間代謝研究工作起到極大的推動作用。