全球人口增長和環(huán)境壓力的雙重挑戰(zhàn)，為傳統(tǒng)畜牧業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展造成巨大的阻力。細(xì)胞培養(yǎng)肉，作為合成生物學(xué)的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一，同時也是新興的食品技術(shù)，以其環(huán)保、高效和人道的特點，或?qū)⒊蔀槲磥硎称房萍及l(fā)展的重要方向。
細(xì)胞培養(yǎng)肉（Cultivated meat），也叫做體外培養(yǎng)肉類，是利用動物細(xì)胞，例如肌肉衛(wèi)星細(xì)胞（SC）、胚胎干細(xì)胞（ESC）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）等，在實驗室條件下培養(yǎng)生長而成的肉類產(chǎn)品。
與傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)相比，細(xì)胞培養(yǎng)肉對生態(tài)環(huán)境的潛在效益更高，表現(xiàn)為顯著降低土地使用面積和淡水使用量，同時大量減少溫室氣體排放、水體富營養(yǎng)化和動物剝削。然而目前細(xì)胞培養(yǎng)肉主要面臨的挑戰(zhàn)來自以下兩個方面：
培養(yǎng)基價格昂貴
培養(yǎng)基占培育肉產(chǎn)品總成本的 95% 以上，需要開發(fā)更優(yōu)秀的無血清培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)培養(yǎng)基，篩選性價比更高的培養(yǎng)基營養(yǎng)組件，比如發(fā)現(xiàn)新的 GF 家族組件等。
種子細(xì)胞來源確認(rèn)
需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的評價用于大規(guī)模擴(kuò)增的細(xì)胞的正確類型和來源。
針對以上問題，來自丹麥奧古斯大學(xué)、加拿大卡爾加里大學(xué)和加拿大多倫多大學(xué)的研究團(tuán)隊，通過體外高通量技術(shù)，開發(fā)了一種用于肌肉細(xì)胞增殖的簡單而穩(wěn)定的無血清培養(yǎng)基，研究結(jié)果發(fā)表在 Food Research International 。
主要研究亮點
采用工程學(xué)研究思路，通過 DOE（Design of Experiments，實驗設(shè)計）和 RSM（Response Surface Methodology，響應(yīng)面法）加速了無血清培養(yǎng)基開發(fā)。
研究表明胎球蛋白、白蛋白、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒和重組 FGF2 是關(guān)鍵培養(yǎng)基成分。
確定了可以維持細(xì)胞增殖的優(yōu)化的成分，類似于 10% 胎牛血清。
開發(fā)的培養(yǎng)基能夠強(qiáng)有力地維持三個物種的肌肉細(xì)胞增殖。
主要開發(fā)流程
通過 Cytation 5 高通量細(xì)胞分析技術(shù)優(yōu)化交互式無血清組分，使用實驗設(shè)計（DOE）和響應(yīng)面方法（RSM）進(jìn)行優(yōu)化。無血清培養(yǎng)基的迭代在 5 天活細(xì)胞實驗中得到驗證，這些實驗采用無標(biāo)記高對比度明場（HCBF）成像模式和長期多代培養(yǎng)實驗。開發(fā)出來的培養(yǎng)基也在其他相關(guān)細(xì)胞類型中進(jìn)一步測試，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究。
圖：無血清培養(yǎng)基開發(fā)的實驗流程
無血清培養(yǎng)基成分的初步篩選和優(yōu)化
研究團(tuán)隊首先使用 Cytation 5 的實時無標(biāo)記成像模式觀察三種原代 BSC（牛衛(wèi)星細(xì)胞）的生肌特征（3day），并采用 WST-1 細(xì)胞增殖測定結(jié)果進(jìn)行培養(yǎng)基組分初篩，進(jìn)一步測試不同的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，確定補(bǔ)充劑的生物活性濃度范圍和最佳 Growth Factor 表現(xiàn)。隨后采用靈敏度更高的 Hoechst 染色計數(shù)法進(jìn)行 DOE 篩選來評價 11 種不同成分的主要影響和相互作用，結(jié)果表明僅用胎球蛋白、BSA 和 FGF2 三種主要成分即可實現(xiàn)最高的相對增殖效果。
圖：采用靈敏度更高的 Hoechst 染色計數(shù)法進(jìn)行 DOE 篩選，評價 11 種不同培養(yǎng)基成分的影響和相互作用
無血清培養(yǎng)基迭代優(yōu)化
研究團(tuán)隊后續(xù)通過 5 天無標(biāo)記活體測定、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、多種細(xì)胞類型、細(xì)胞附著測定和多傳代長期實驗對該培養(yǎng)基的方案進(jìn)行驗證以及穩(wěn)定性測試，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和基礎(chǔ)添加劑的優(yōu)化、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 Tri-basal 的條件優(yōu)化、FGF2 類型優(yōu)化等工作，最終確認(rèn)優(yōu)化的 Tri-basal 2.0+ 培養(yǎng)基增強(qiáng)了無血清細(xì)胞附著和長期增殖，為在培育肉生產(chǎn)中使用胎牛血清提供了替代解決方案。
圖：通過 96 孔整孔 Hoechst 的細(xì)胞核計數(shù)測定進(jìn)優(yōu)化篩選方案，以提高準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性
圖：5 天無標(biāo)記活細(xì)胞成像細(xì)胞增殖定量分析（HCBF）用于評價含有 10% 胎牛血清（FBS）和 Tri-basal 2.0+ITS 樣本的基底細(xì)胞（BSC）增殖情況
圖：通過細(xì)胞核計數(shù)及 5 天活細(xì)胞增殖（HCBF）實驗結(jié)果表明，Tri-basal 2.0+ Ento 在 5 天的時間內(nèi)表現(xiàn)出出色的持續(xù)增殖能力，通過去除抗生素再次得到改善，并且優(yōu)于含有 10% FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。
圖：Cytation 5 對免疫熒光染色后的細(xì)胞進(jìn)行成像，Gen 5 定量測定 MHC 陽性肌管(面積)、融合指數(shù)和總核數(shù)，用于評價培養(yǎng)基成分對細(xì)胞生肌能力的影響。
應(yīng)用方案小結(jié)
本研究中，精確高效的高通量增殖測定技術(shù)至關(guān)重要
由于 WST-1 測定缺乏靈敏度，且容易受到試劑本身的影響導(dǎo)致結(jié)果的偏差
使用 Cytation 5 系統(tǒng)和 Gen 5 軟件進(jìn)行基于圖像的細(xì)胞定量計數(shù)改變了傳統(tǒng)的使用 WST-1（代謝測定）檢測方法的缺陷。
使用 Cytation 5 進(jìn)行基于 Hoechst 的自動化細(xì)胞核計數(shù)更加準(zhǔn)確、便宜且快速，不僅能夠糾正細(xì)胞接種數(shù)量變化引入的誤差，還能夠統(tǒng)一分析標(biāo)準(zhǔn)，提高分析精確度。
儀器方案推薦
Cytation 5 & Gen 5 用于開發(fā)無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢：精確、高效、自動化
主要應(yīng)用：
WST-1 細(xì)胞增殖檢測
Hoechst 96 孔板整孔細(xì)胞核計數(shù)
高通量無標(biāo)記活細(xì)胞增殖分析
多次傳代活細(xì)胞增殖檢測
細(xì)胞免疫熒光成像分析成肌能力
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