關(guān)于
Colony Formation Assay
Colony Formation Assay——克隆形成實(shí)驗(yàn)，是測定細(xì)胞存活率和考察單個細(xì)胞增殖能力的有效方法，屬于一種細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)中，克隆形成率是一個關(guān)鍵指標(biāo)。
Colony Formation Assay 的重要作用
克隆形成實(shí)驗(yàn)可以用于檢測細(xì)胞干預(yù)是否影響細(xì)胞的增殖和存活能力；
通過體外克隆形成能力強(qiáng)弱來評價細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性；
對癌癥藥物篩選來說，克隆形成實(shí)驗(yàn)可以通過驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞在特定的環(huán)境下的增殖能力方面的敏感性，用于藥物篩選及腫瘤免疫治療的效果評估。
手動實(shí)驗(yàn)方法：
手動的克隆形成實(shí)驗(yàn)，通常將對數(shù)生長期的單層細(xì)胞消化離心，倍比稀釋后以 50、100、200 個細(xì)胞的梯度密度接種于 6 孔板中靜置培養(yǎng)，中間給與細(xì)胞處理，細(xì)胞增殖形成克隆后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下肉眼觀察并計(jì)數(shù)，選取 50 個細(xì)胞以上的克隆進(jìn)行克隆形成率計(jì)算。
圖 1 基于 6 孔板的傳統(tǒng)克隆形成計(jì)數(shù)，并非每一個細(xì)胞群都可以算是一個克隆
手動克隆形成試驗(yàn)對操作人員的操作技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)依賴較高，通常使用低密度孔板（6 孔板）便于顯微鏡下手動計(jì)數(shù)。這種方法限制了通量，并依賴于主觀定量。
在 AI 時代，檢測技術(shù)和方法的進(jìn)步帶來的不僅是高效穩(wěn)定，同時客觀真實(shí)且數(shù)據(jù)可溯源。
自動化常常意味著可以提高通量，從而節(jié)省大量的操作和時間成本，對于克隆形成實(shí)驗(yàn)來說也是如此。Agilent BioTek Cytation 7 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀的定量顯微成像技術(shù)，可以在 6-96 孔板中完成克隆形成實(shí)驗(yàn)的自動化成像與分析過程：全孔成像，自動識別、量化和表征克隆。
更高的通量可以幫忙研究者在更短的時間內(nèi)，獲得更可靠的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)，無論是在重復(fù)性方面，還是在更廣泛的藥物劑量范圍需求內(nèi)。
圖 2，使用 Agilent BioTek Cytation 7 在 6 孔板和 96 孔板中進(jìn)行克隆成像實(shí)驗(yàn)的示意圖
通常，判斷一群細(xì)胞是否是一個克隆的標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù)量不少于 50 個，人工手動計(jì)數(shù)費(fèi)用費(fèi)力，智能化時代如何快速對克隆形成進(jìn)行判斷呢？
Cytation 7 自動化顯微成像提供的巧妙算法
——準(zhǔn)確且高效
1對孔板中的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫和 Hoechst 33342 染色(圖 3A 和 3D)，然后使用熒光通道進(jìn)行成像，雙 Mask 分析分別識別并標(biāo)記細(xì)胞群邊界（一級 Mask）和細(xì)胞群內(nèi)的細(xì)胞(二級 Mask)
2以此建立細(xì)胞群面積與細(xì)胞數(shù)量相關(guān)聯(lián)的線性方程(圖 3B和 3E)，由此方程估算 50 個細(xì)胞組成的面積，進(jìn)而用于校準(zhǔn)細(xì)胞分析工作流。
3在后續(xù)的高通量分析中，使用彩色明場成像模式進(jìn)行全孔成像，并應(yīng)用之前確定的陽性克隆面積進(jìn)行分析：至少包含 50 個細(xì)胞的克隆亞群才可以被標(biāo)記和量化(圖 3C 和 3F)。
圖 3，克隆大小與細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性.通過熒光成像結(jié)晶紫和 Hoechst 33342 染色的 Caco2 (A) 和 HeLa (D) 克隆。擬合克隆面積與細(xì)胞數(shù)量（細(xì)胞核）的相關(guān)性，通過線性方程計(jì)算含 50 個細(xì)胞的克隆的估算面積，Caco2 和 HeLa 細(xì)胞的 50 個細(xì)胞集落面積分別為 1.03×106 和 9.0×105 μm2。這些值應(yīng)用于結(jié)晶紫染色菌落 (C 和 F) 的彩色明場圖像。比例尺= 200 μm
Agilent BioTek Cytation 7 是一款獨(dú)特的細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀，同時具備寬場倒置熒光顯微鏡、正置明場顯微鏡和強(qiáng)大的圖像分析工具，非常適合于以 6 孔板和 96 孔板進(jìn)行自動化克隆形成實(shí)驗(yàn)。
圖 4，使用 96 孔板進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)
Cytation 7 除了能夠提供高質(zhì)量圖像用于定量分析之外，其自動化分析速度也非常快。
5 分鐘，完成基于 96 孔板的克隆形成分析，從圖像捕獲到得出數(shù)據(jù)。
30 分鐘，完成 6 塊 6 孔板的克隆成像、識別和量化分析，包括生成 11 個藥物濃度處理的 EC50 劑量響應(yīng)曲線。相比之下，手動操作可能需要 4 個小時。
表 1，Cytation 7 在 6 孔板和 96 孔板上進(jìn)行克隆形成分析時間
我們?yōu)榭寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)開發(fā)了一種快速、定量和可靠的方法，利用 BioTek Cytation 7 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀的正置顯微成像模式來自動化成像，并使用強(qiáng)大的圖像分析工具來定義細(xì)胞閾值對克隆進(jìn)行客觀檢測和定量。這種自動化解決方案提供了符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)采集結(jié)果、靈活的通量選擇，并大大的縮短時間周期，這對癌癥研究等相關(guān)的藥物開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要。
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Colony Formation Assay 實(shí)驗(yàn)指南
