未來餐桌革命：安捷倫高通量細胞成像在細胞培養(yǎng)肉行業(yè)的應(yīng)用-下

2024.9.14

細胞培養(yǎng)肉（Cultivated meat），也叫做體外培養(yǎng)肉類，是利用動物細胞，例如肌肉衛(wèi)星細胞（SC）、胚胎干細胞（ESC）、間充質(zhì)干細胞（MSC）和誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）等，在實驗室條件下培養(yǎng)生長而成的肉類產(chǎn)品。

在60秒科研速覽 | 安捷倫高通量細胞成像在細胞培養(yǎng)肉行業(yè)的應(yīng)用-上，我們介紹了來自丹麥奧古斯大學(xué)、加拿大卡爾加里大學(xué)和加拿大多倫多大學(xué)的研究團隊，通過體外高通量技術(shù)，開發(fā)了一種用于肌肉細胞增殖的簡單而穩(wěn)定的無血清培養(yǎng)基，為目前新興的細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域提供了性價比更高的選擇。

該研究團隊后續(xù)又開發(fā)了一種新穎的肌管定量分析方法，將有助于幫助研究者選擇大規(guī)模培養(yǎng)的細胞的正確類型和來源，以及最佳的擴增時機。

研究背景和思路

細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)，主要依賴于從動物捐獻者連續(xù)獲取的原代肌肉衛(wèi)星細胞（SC），而這些細胞的適用性受多種因素影響，比如年齡、性別、品種以及供體動物的持續(xù)性和可獲得性等。

研究團隊使用?Cytation 5 細胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)，開發(fā)了一種新穎的基于高對比度明場無標(biāo)記（HCBF）技術(shù)的肌管定量方法，并通過鬼筆環(huán)肽染色實現(xiàn)了更有效的終點融合分析。

通過這種定量分析方法，評估了公牛和奶牛肌肉樣本中提取的牛 SC 在不同培養(yǎng)基條件下的增殖與分化能力，研究發(fā)現(xiàn)公牛的衛(wèi)星細胞比奶牛的衛(wèi)星細胞增殖得更快；無血清培養(yǎng)基比胎牛血清能更好地維持細胞增殖。后續(xù)利用基因芯片轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，研究團隊詳細分析了兩種供體細胞之間的多個差異表達基因，為觀察到的細胞行為差異提供了解釋。

圖：牛衛(wèi)星細胞定量分析流程示意圖

HCBF 無標(biāo)記肌管定量分析方案

使用 Cytation5 的高對比度明場成像（HCBF）模式，可以通過添加一個特定高度的成像圖層，用于有效識別整個肌管而非單個細胞。在配套 Gen5 軟件中，先通過圖像處理提高肌管的對比度，后續(xù)通過細胞分割參數(shù)設(shè)置對肌管進行量化（識別輪廓顯示為黃色，下圖 A）。

下圖 B 中展示了傳統(tǒng)的基于免疫熒光的高分化的肌肉衛(wèi)星細胞（SCs）成像結(jié)果，其中 Phalloidin-AF647 染色顯示了 F - 肌動蛋白（紅色），Hoechst 染色揭示了細胞核（藍色）。研究者對比了 HCBF 法和傳統(tǒng)的熒光染色法，通過軟件的分割參數(shù)優(yōu)化，兩種方法均能夠更有效的識別肌管區(qū)域。

圖：使用 HCBF 的無標(biāo)記肌管定量分析

使用基于 HCBF 計數(shù)無標(biāo)記定量 SC 增殖和分化

活細胞水平動態(tài)評價 SC 的增殖速率以及分化狀態(tài)能夠提供更豐富的細胞評價定量數(shù)據(jù)。

研究團隊采用 Cytation5 的活細胞檢測功能，通過 HCBF 模塊動態(tài)成像拍攝肌管結(jié)構(gòu)，使用 Gen5 對生成的失焦圖像進行預(yù)處理和分析，下圖 A 展示了使用 HCBF 計數(shù)方案定量兩種細胞系在不同的培養(yǎng)基方案中的增殖情況；圖 B&C ：定量結(jié)果顯示奶牛組的細胞數(shù)量均顯著低于小牛組。圖 2D：第一個早期肌管在 FM（低血清培養(yǎng)）中于第 2 天形成，證實了肌源性轉(zhuǎn)變。圖 2E：FM 中的融合程度從第 2 天到第 3 天急劇增加，所有樣本的肌管面積均顯著增加。

圖：使用基于 HCBF 的無標(biāo)記量化的 SC 增殖和分化結(jié)果

肌細胞核和融合指數(shù)熒光成像定量方案

無標(biāo)記檢測在活細胞動態(tài)生長過程中能夠提供最為便捷快速的肌管生成定量結(jié)果，而熒光標(biāo)記分析能夠?qū)毎撕腿诤现笖?shù)進行定量，提供更多分析參數(shù)。

研究團隊在無標(biāo)記細胞動態(tài)監(jiān)測的終點，建立了熒光染色標(biāo)記法的定量分析方案，實現(xiàn)了一個樣本，獲得最大化的定量數(shù)據(jù)。下圖 A 展示了鬼筆環(huán)肽（紅色）和 Hoechst （藍色）分別標(biāo)記肌管絲狀肌動蛋白 (F-actin) 和細胞核，通過熒光成像分析對 HCBF 進行驗證，并開展更多的分析數(shù)據(jù)輸出；圖 3B-F：Gen5 識別總肌管細胞面積，和總細胞核計數(shù)一起用于定量確定總肌管面積 (μm 2) (B)、總細胞核 (C)、融合指數(shù)（肌細胞核占總細胞核的百分比）(D)、肌核 (E) 和每個肌管面積的肌核（以毫米 2 為單位）(F)。