實(shí)驗(yàn)原理

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二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離）以及SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)行分離）。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。

通常第一維電泳是等電聚焦，在細(xì)管中（φ1～3 mm）中加入含有兩性電解質(zhì)、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30 min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。

將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維電泳過程中，結(jié)合 SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進(jìn)入SDS－聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。

這樣各個(gè)蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細(xì)胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個(gè)蛋白質(zhì)，有些報(bào)道可以分辨出5000～10000個(gè)斑點(diǎn)，這與細(xì)胞中可能存在的蛋白質(zhì)數(shù)量接近。由于二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細(xì)胞提取液中檢測(cè)某個(gè)蛋白。

實(shí)驗(yàn)步驟

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1. 第一向等電聚焦

?? 1) 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室溫溶解。

?? 2) 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。

?? 3) 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。

?? 4) 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。

?? 5) 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。

?? 6) 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。

?? 7) 分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有 ）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。

?? 8) 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。

?? 9) 對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。

?? 10) 聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。

2. 第二向SDS-PAGE電泳

? 1) 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。

?? 2) 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。

?? 3) 從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。

?? 4) 配制膠條平衡緩沖液I。

?? 5) 在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。

?? 6) 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

?? 7) 配制膠條平衡緩沖液II。

?? 8) 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

?? 9) 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上。

?? 10) 將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。

?? 11) 將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。

?? 12) 第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

?? 13) 將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。

?? 14) 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。

?? 15) 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。

?? 16) 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。

?? 17) 在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。

?? 18) 在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。

?? 19) 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。

?? 20) 進(jìn)行染色。