免疫化學(xué)發(fā)光并非萬能，單分子免疫檢測未來可期（一）
前言
?????? 化學(xué)發(fā)光技術(shù)已經(jīng)成為當前免疫診斷市場中最重要的檢測技術(shù)。自上世紀70年代誕生以來，盡管隨著檢測設(shè)備全自動化水平以及檢測元件精密度、試劑生產(chǎn)保存工藝的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的檢測靈敏度有了顯著的提升，然而究其本質(zhì)而言，無論是酶促發(fā)光、直接發(fā)光或是電化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光技術(shù)在檢測原理上在過去的近50年里并沒有得到任何改變?？梢哉J為在自動化水平已經(jīng)達到相當高程度的今天，化學(xué)發(fā)光技術(shù)在現(xiàn)有抗體親和力水平的前提下，已經(jīng)接近了其檢測能力的極限。
免疫診斷市場在新型標志物或新型診斷市場上的開拓，可能需要一種從檢測原理層面進行變革的新型免疫診斷技術(shù)——單分子免疫檢測。
?????? 本文將分為以下幾個部分探討下一代免疫診斷技術(shù)——單分子免疫檢測對現(xiàn)有免疫診斷市場的影響以及在體外診斷市場普及應(yīng)用的可行性。
（1）??化學(xué)發(fā)光發(fā)展現(xiàn)狀
（2）??單分子檢測技術(shù)——生物檢測技術(shù)的極限標尺
（3）??從化學(xué)發(fā)光到單分子免疫檢測有多遠
（4）??數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展給單分子免疫檢測的啟示
（5）??單分子免疫檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀
（6）??單分子免疫檢測平臺技術(shù)分析
（7）??單分子檢測技術(shù)是分子檢測與免疫檢測平臺統(tǒng)一化的可行橋梁
（8）??超低成本單分子免疫檢測技術(shù)實現(xiàn)的可能性
1.????化學(xué)發(fā)光技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀
當今全球范圍內(nèi)，免疫診斷市場呈現(xiàn)以大型全自動化學(xué)發(fā)光為主流，多種檢測技術(shù)原理、檢測平臺形式多樣化發(fā)展的局面。
國內(nèi)高端免疫診斷市場中，大型全自動化學(xué)發(fā)光設(shè)備基本處于羅氏、雅培、西門子等國際巨頭企業(yè)壟斷狀態(tài)。盡管邁瑞、新產(chǎn)業(yè)等國內(nèi)龍頭企業(yè)近幾年得到迅速發(fā)展，但是短期內(nèi)依然難以改變目前市場份額分配的局勢。
而在POCT細分領(lǐng)域，則有以梅里埃VIDAS、三菱PATHFAST、星童Pylon等為代表的小型全自動單人份POCT試劑條，以美艾利爾、廣州萬孚、南京基蛋為代表的免疫層析試紙，以及雅培iSTAT、華邁興微極光系列、理邦的磁敏免疫產(chǎn)品為代表的微流控POCT產(chǎn)品。化學(xué)發(fā)光技術(shù)憑借其絕對領(lǐng)先的靈敏度、準確性與精密度，無疑是當前免疫診斷技術(shù)中最可靠的檢測方法，它貫穿了從全自動大型設(shè)備，到小型全自動POCT設(shè)備甚至到微流控POCT的全線免疫診斷產(chǎn)品。
然而，當我們對免疫診斷技術(shù)發(fā)展歷史進行梳理時候，就會發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光并不是一個新技術(shù)。化學(xué)發(fā)光技術(shù)從上世紀70年代中期誕生，到上世紀末以及本世紀初由于羅氏、雅培、西門子等企業(yè)通過收購或自主研發(fā)推出各大早期化學(xué)發(fā)光平臺而受到廣泛關(guān)注，再到近十年隨著自動化技術(shù)的迅速發(fā)展，替代了酶聯(lián)免疫成為免疫診斷市場最核心的技術(shù)，已經(jīng)經(jīng)歷了超過40年的時間。
而在這40年里，無論是酶促化學(xué)發(fā)光、直接化學(xué)發(fā)光或是電化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光的檢測技術(shù)卻并沒有任何檢測原理層面上的改變，現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光檢測在靈敏度、準確度的提升幾乎是完全依賴于自動化設(shè)備精密度的提升以及發(fā)光分子衍生物結(jié)構(gòu)上的改造。
在過去化學(xué)發(fā)光技術(shù)快速發(fā)展的近二十年里，我們習慣了依賴于自動化技術(shù)快速發(fā)展給免疫診斷市場帶來的精確度與可靠性的提升，卻也習慣了化學(xué)發(fā)光方法在檢測技術(shù)原理上給我們帶來試劑或設(shè)備層面的各種枷鎖，形成了定式思維，難以在檢測原理層面實現(xiàn)革新。
2.????單分子檢測技術(shù)——生物檢測技術(shù)的極限標尺
1967年法國數(shù)學(xué)家B.B.Mandelbrot在其分形理論中提出了“英國的海岸線有多長”的問題。該理論認為，英國海岸線的長度取決于測量尺子的精確程度。隨著尺子逐漸變小，精確程度逐漸提高，測量所得的海岸線長度將無限增大。與“英國海岸線有多長”的問題相似，我們對生命科學(xué)領(lǐng)域的認知范圍也是隨著各種生物檢測技術(shù)靈敏度和精確程度的提升而逐漸提升的。
不同的是，在生物分析檢測領(lǐng)域，尺子的最小尺寸似乎是有極限的——單分子水平。包括核酸、蛋白質(zhì)或是多糖在內(nèi)的絕大部分生物分析系統(tǒng)，當檢測對象超越了分子水平到達原子水平，檢測都將失去其本來的意義。單分子水平的生物標志物的研究，為前沿科學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)療診斷領(lǐng)域都提供了難以估量的學(xué)術(shù)價值與市場機會。
3.????從化學(xué)發(fā)光到單分子免疫檢測有多遠
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?圖1 吖啶酯發(fā)光過程中的光子方向隨機性
?????? 現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)是一種自上而下的檢測邏輯，它通過測量溶液整體光學(xué)信號強度換算分子濃度。以吖啶酯化學(xué)發(fā)光為例，化學(xué)發(fā)光設(shè)備通常是以光電倍增管（PMT）直接檢測溶液整體釋放的光子數(shù)，通過積分或發(fā)光強度的形式來實現(xiàn)定量檢測。現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光體系為了提高吖啶酯化學(xué)發(fā)光檢測體系的靈敏度，除了抗體親和性因素的影響，更為簡單直接的方法就是提高反應(yīng)體系的整體體積，從而在一定樣品濃度下提高檢測液中結(jié)合的吖啶酯分子的總數(shù)，來提高被PMT檢測到的光子總數(shù)。然而這種檢測形式并不適合于單分子水平的檢測。
要實現(xiàn)單分子免疫檢測必須要實現(xiàn)兩個前提：
（1）單分子信號檢測
（2）單分子信號溯源。
前者是單分子檢測的基礎(chǔ)條件，而后者則是通過單分子計數(shù)實現(xiàn)定量檢測的必須條件。
現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)不可能實現(xiàn)單分子免疫檢測，其檢測靈敏度下限的瓶頸來源于分子層面的不確定性。吖啶酯分子在遇到發(fā)光激發(fā)底物時，會在極短的時間內(nèi)釋放數(shù)個光子，其后結(jié)構(gòu)迅速遭到破壞失去發(fā)光能力。由于吖啶酯分子在釋放光子時，光子方向是不可控的，而作為發(fā)光檢測設(shè)備的核心部件光電倍增管卻是有方向性的（圖1）。這就使得單個吖啶酯釋放的少數(shù)幾個光子不能確保被PMT檢測到（不滿足第一點前提條件），同時PMT上捕獲的光子信號也不可能對溶液中單個吖啶酯分子進行溯源（不滿足第二點前提條件）。
當樣品中的抗原分子濃度低到一定程度時，PMT能夠捕獲到光子數(shù)量的不確定性將呈指數(shù)級提高，導(dǎo)至檢測信號完全被埋沒于背景噪音中，失去定量檢測能力。同樣的問題也存在于電化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光體系中。
因此，在設(shè)備自動化技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到相當高水平的今天，現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測靈敏度已經(jīng)接近于其理論上的檢測極限水平。
對于現(xiàn)有的免疫檢測體系而言，若需要以更高靈敏度的檢測方法去探尋新的生物標志物，或是開發(fā)新型免疫診斷市場方向，勢必需要在檢測原理層面上進行技術(shù)本質(zhì)的革新。
4.????數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展給單分子免疫檢測的啟示
圖2 數(shù)字PCR工作原理
（PNASAugust 3, 1999 96 (16) 9236-9241; DOI: pnas.96.16.9236）
