抗體抗原血清

NaHCO3緩沖液抗體稀釋液

加樣器試管聚苯乙烯珠洗瓶、抽濾裝置

1. ?包被抗體　

在每個(gè)小試管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M，PH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋的抗HBsAg抗體，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，置4 ℃過(guò)夜。

　　
2. ?洗滌　

用抽濾針頭吸干管內(nèi)液體，加入Tris-HCl-Tween20洗滌3 次，每次加2 ml，放置3～5 min，用抽濾針頭吸干管內(nèi)液體。

　　
3. ?加待檢血清和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品　

用PBS-Tween20緩沖液不同倍數(shù)稀釋HBsAg陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品或待檢血清，每管加入300 μl。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，空白對(duì)照管只加抗體稀釋液。置37 ℃孵育2 h。

　　
4. ?洗滌　

同2。

　　
5. ?加酶標(biāo)抗體　

用含小牛血清的PBS-Tween20緩沖液稀釋HRP標(biāo)記的抗HBsAg抗體，每管加入300 μl，空白對(duì)照管只加用于稀釋酶標(biāo)抗體的稀釋液。置37 ℃孵育2 h。

　　
6. ?洗滌　

同2。

　
7. ?化學(xué)發(fā)光測(cè)定　

給每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保溫20 min。然后將小試放入LKB-1250 lumimeter中，并置于測(cè)量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。記錄儀記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

　　
8. ?同時(shí)用ELISA方法進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果測(cè)量采用DG3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1. ?洗滌要徹底，以免因血清中其他來(lái)源的過(guò)氧化物酶類物質(zhì)所產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)，而影響測(cè)定結(jié)果。

　　
2. ?實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)分別設(shè)置陽(yáng)性、陰性、空白對(duì)照來(lái)控制實(shí)驗(yàn)條件，且每份樣品均應(yīng)做三個(gè)復(fù)管，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　
3. ?為了克服酶標(biāo)抗體因非特異性吸附而造成的較高本底，可用適量小牛血清加以抑制。

　
4. ?當(dāng)加入luminol后，迅速產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光并使發(fā)光在一秒鐘內(nèi)達(dá)到峰值，然后很快衰減到基線水平。因此，只有當(dāng)小試管置于儀器的測(cè)量位置時(shí)，方可加入luminol。

　　
5. ?底物的加入，是為了增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。但只有當(dāng)?shù)孜锓肿优c酶催化活性中心充分接觸時(shí)，反應(yīng)速度才能加快。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行15 min達(dá)到平衡時(shí)，牷學(xué)發(fā)光強(qiáng)度則不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化，且在1 h內(nèi)保持穩(wěn)定，因此，控制底物與酶反應(yīng)15 min后加luminol進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定。

一、結(jié)果判定

1. ?定性　

按下列公式判別陰、陽(yáng)性

　　　L樣品－L空白　　 ? ? ?┌≥2.1　為陽(yáng)性

S/N ＝ ────────?。健∩泰?/span>

　 ? ? L陰性對(duì)照－L空白 ? 　 └＜2.1　為陰性

　　
2. ?定量　

以不同稀釋度的HBsAg陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，不同稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，作出劑量反應(yīng)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線），待測(cè)樣品中HBsAg的含量就可由測(cè)量的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度換算得到。