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亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測甲基化——DNA甲基化

關(guān)鍵詞: DNA,修飾,甲基化,亞硫酸氫鹽來源: 
實驗方法原理

重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變,用PCR擴增(引物設(shè)計時盡量避免有CpG,以免受甲基化因素的影響)所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。最后對PCR產(chǎn)物進行測序,并且與未經(jīng)處理的序列比較,判斷是否CpG位點的甲基化狀態(tài)。

實驗材料

DNA

試劑、試劑盒

NaOH苯二酚(氫醌)亞硫酸氫鈉石蠟油

儀器、耗材

離心管恒溫水浴鍋鋁箔紙

實驗步驟

1.將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul;

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2.加5.5ul新鮮配制的3M NaOH;?

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3. 42℃水浴30min;

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水浴期間配制:

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4.10mM對苯二酚(氫醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液變成淡黃色)

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5. 3.6M亞硫酸氫鈉(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶,但加入NaOH后會慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

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6.EP管外裹以鋁箔紙,避光,輕柔顛倒混勻溶液。?

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7.加200 ul 石蠟油,防止水分蒸發(fā),限制氧化。

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8.50℃避光水浴16h。

收起?
注意事項

避免化學(xué)品或外源DNA的污染。

其他

甲基化是目前的研究熱點,就我所做的一點工作并其中一點心得,與大家分享。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?/p>

第一部分 基因組DNA的提取。

這一步?jīng)]有懸念,完全可以購買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒,如果實驗室條件成熟,自己配試劑提取完全可以。DNA比較穩(wěn)定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。

此步重點在于DNA的純度,即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。

使用兩者的細(xì)節(jié):

1:蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml;

2:RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在購買市售RNA酶后進行再處理,配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA,連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。

驗證提取DNA的純度的方法有二:

1:紫外分光光度計計算OD比值;

2:1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

我傾向于第二種方法,這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度,并根據(jù)Marker的上樣量估計其濃度,以用于下一步的修飾。

第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

如不特別指出,所用雙蒸水(DDW)均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。

1:將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul;

2:加5.5ul新鮮配制的3M NaOH;

3: 42℃水浴30min;

水浴期間配制:

4:10mM對苯二酚(氫醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液變成淡黃色)

5: 3.6M亞硫酸氫鈉(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶,但加入NaOH后會慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6:EP管外裹以鋁箔紙,避光,輕柔顛倒混勻溶液。

7:加200 ul 石蠟油,防止水分蒸發(fā),限制氧化。

8:50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm開始做,熟練的話不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,時間上很合適。

這一步細(xì)節(jié):

1:基因組DNA的量不需十分精確,寧多勿少,因為在以后純化回收步驟中會有丟失,且此方法修飾最多可至4ug。

2:所有試劑均須新鮮配制,所以配液的技術(shù)要過關(guān),既要快,又要精確。

3:亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性,一定用堿將PH調(diào)制5.0,否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。

4:水浴最好達(dá)16小時,雖可以短至8小時,但后者修飾會有不完全。

推薦方法

推薦耗材

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