實驗原理

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聚丙烯酰胺凝膠電泳是利用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)與N，N亞甲基雙丙烯酰胺(N，Nmethylene bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下，聚合成大分子凝膠后，加樣，再進行電泳的一種方法。聚丙烯酰胺凝膠是一種網(wǎng)狀的立體結構，其孔徑大小可以控制，用這種凝膠進行電泳，同時具有電泳和分子篩的雙重作用。當樣品通過凝膠進行電泳時，便可依據(jù)樣品中各種分子的電荷不同與分子量大小或構型的差異而將各成分分開。由于聚丙烯酰胺凝膠化學性質穩(wěn)定，很少帶有側基，吸附作用與電滲作用均小，所以具有很高的分辨率與敏感性。

實驗試劑

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1. 20%的單體母液：

丙烯酰胺 19.6 g

N，N亞甲基雙丙烯酰胺0.4 g

加蒸餾水至 100 ml

2. TrisEDTA緩沖液(pH值6.8)：

0.5mol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)60.57 g

0.04mol/L EDTA (乙二胺四乙酸) 11.7 g

加蒸餾水稀釋至 100 ml

3. β二甲基胺基丙腈(DMPN)液：

取原液(4℃保存)或用前稀釋至50%濃度

4. 10%過硫酸銨溶液：

過硫酸銨 0.5 g

加蒸餾水 5 ml

注：需在使用時配制。配制后保存于4℃。

5. 0.025mol/L pH值9.0硼酸緩沖液(電泳槽用)：

母液

硼酸 49.48 g

硼砂 30.512 g

加蒸餾水至 1 000 ml[HJ]

使用液：取母液90ml加蒸餾水至1 440ml即成。

實驗步驟

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1. 樣品處理：取待檢樣品與標準品(對照)各0.1ml，加入0.5%溴酚藍指示劑各1滴，再加入25%蔗糖各0.1ml，混合均勻備用。

2. 凝膠管制備：取20%單體母液3.6ml，TrisEDTA緩沖液(pH值8.8)12ml，加7ml蒸餾水混勻，再加入βDMPN液0.05ml，10%過硫酸銨0.15ml，混勻，于5min內完成。將0.5×7.5cm兩端開口的小玻璃管，一端用橡皮薄膜包扎封閉，插入有孔的橡皮塞孔洞中，將上述混合液立即裝入小玻璃管內，上端留10cm空處，再加入蒸餾水至滿，注意勿產(chǎn)生氣泡。于室溫下靜止30min，使之聚合成凝膠。

3. 加樣：用毛細管吸去凝膠管上端的蒸餾水，緩緩加入已處理的樣品于凝膠柱面上，每種樣品加1管。每管留0.5ml空處，再加入蒸餾水至滿。操作過程不得產(chǎn)生氣泡和沖擊凝膠面。

4. 電泳：除去凝膠玻管下端之橡皮薄膜，將凝膠玻管連同有孔橡皮塞一起插入電泳槽的孔洞中，并作好標記，其余未插凝膠管之孔洞以無孔膠塞填塞。于上、下電泳槽中各加入0.025mol/L pH值9.0硼酸緩沖液，液面應將凝膠管兩端淹沒。以正負極分別聯(lián)接下槽與上槽的電極插座，接通電源進行電泳。起始電流應小，用1mA/管，待示蹤染料到達分離膠后，將電流增加到2～5mA/管。在考慮到電流的同時，也要考慮到電壓，開始用100～150V，待樣品進入到分離膠時，電壓可升到250V。一般如用4mA/管電流，于20℃電泳約需40min。也可根據(jù)溴酚藍指示劑移動下降情況，掌握電泳時間。當指示劑下降到距凝膠玻管下口約0.5cm時，關閉電源，停止電泳。

5. 剝膠：電泳畢，取出凝膠玻管，以帶有8～10cm長針頭的注射器吸取水，將針頭徐徐插入凝膠玻管內壁與凝膠柱間，邊推進，邊注水，待針頭快到管底時，沿原路退出針頭，另換一處重復上述操作，反復幾次，凝膠柱即可與玻管剝離。此時，于管的一端稍稍加壓，即可將凝膠柱由玻管內擠出。

6. 染色處理：將凝膠柱浸泡于0.5%氨基黑10B染色液中，浸染1h，取出凝膠柱，用水沖去柱上沾附之染液，放于7%冰醋酸中脫色，約一天，可脫到背底無色。然后將凝膠柱浸于2%冰醋酸之細玻管中保存。也可作電泳染色和脫色。即在電泳后不取下凝膠玻管，而將上、下槽緩沖液換成7%冰醋酸，并于凝膠玻管內加入氨基黑10B染料(加入少許蔗糖，避免染料與醋酸混合)，電泳時，染料可自動將蛋白各成分染色并經(jīng)醋酸脫去背底顏色。

7. 結果

對電泳后的結果，可用下列方法進行判定：

?? 1) 定性分析：以凝膠染色的區(qū)帶圖樣與標準品圖樣進行對比鑒定。

?? 2) 定量分析：可選用以下方法：

????? a. 進行直接光密度掃描；

????? b. 把凝膠切成等距的薄片，洗脫，用生物化學方法作洗脫液的比色測定；

????? c. 放射性同位素法，在樣品中加入標記同位素，如?3 H、?14 C等，電泳后，用計數(shù)器測量放射活性，計算結果。

注意事項

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1. 樣品的離子強度、pH值盡可能與濃縮膠液相同，如含大量鹽時，應經(jīng)透析除鹽。樣品的蛋白濃度以1mg/ml為宜。

2. 丙烯酰胺和N，N亞甲基雙丙烯酰胺的貯存液，會因水解后產(chǎn)生丙烯酸與氨而失效，也可因水解而變質。故應裝在棕色瓶中，冰箱保存可以延緩失效期。最好每月配制一次。一般應測定其pH值(4.9～5.9)，過低則難以聚合。

3. 過硫酸銨溶液最好當天配制，冰箱保存，最多不超過1周。

4. 凝膠應充分聚合，室溫低時，可適當延長聚膠時間，在37℃溫箱中可促進凝膠聚合。凝膠柱面應整齊，在操作過程中，不要產(chǎn)生氣泡，否則電泳后區(qū)帶不整齊。

5. 電泳中應保持電流穩(wěn)定，避免電流強度過高，而產(chǎn)生大量的熱，使分離失敗。

6. 緩沖液可再行使用，但應注意上下槽緩沖液不能混合或互換。因下槽中混入了催化劑及氯離子，如將下槽的緩沖液用于上槽，則影響電泳。

7. 如凝膠濃度較高，剝膠困難時，可用10%甘油水溶液代替水注入。

8. 丙烯酰胺和N，N亞甲基雙丙烯酰胺這兩種單體，可引起神經(jīng)中毒與刺激皮膚粘膜的作用，應注意自身防護。

9. 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入適量(如0.1%)的十二烷基硫酸鈉(SDS)為助溶劑，可以測定生物大分子的分子量，研究復合蛋白質的單體性質，獲得明晰的電泳圖譜。